为初级大脑神经元开发的健壮和特定的基因调控工具

一种强大的新工具可用于神经科学研究大脑发育、记忆和学习机制，以及大脑失调在成瘾、抑郁、精神分裂症和阿尔茨海默病等神经精神疾病中的作用。

在伯明翰研究人员阿拉巴马大学的这种分子生物学工具开发和验证 - 能够选择性和强大地开启基因在神经元。它已被递送至在菜肴中生长的神经元，更重要的是，它也被交付给了脑活体成年大鼠的神经元。该工具可以增加表达式同时单个基因或多种基因的表达，可以控制增加的基因表达量。

这种增加基因表达的选择能力 - 这意味着基因制备更多mRNA，即更多蛋白质的代码使研究人员能够查询个体基因或基因组的作用。

这些查询是构建块，以了解如何在开发过程中的不同基因程序的表达控制控制脑生长，布线和所产生的神经元的类型。对于成年大脑，该工具可以帮助解释神经活动和行为经验改变的基因计划如何导致适应行为。该工具还可以帮助调查基因计划的失调 - 其中许多涉及神经精神疾病 - 发生大脑发育或者在发育完全的成人大脑中。

该工具采用众所周知的基于CRISPR的技术，该技术被包装成慢病毒，以稳定地引入神经元。

“基于crispr的技术为研究基因功能提供了新的途径，但在有丝分裂后神经元中转基因表达的困难推迟了这些工具的整合中枢神经系统弗吉尼亚大学研究小组负责人杰里米·戴博士说。“在这里，我们展示了一种高效、神经元优化的双慢病毒crispr转录激活系统，能够实现稳健、模块化和可调的基因诱导和多路复用基因调节跨越几个主要啮齿动物神经元培养系统。“

他是UAB医学院神经生物学学系的助理教授，也是UAB公民国际研究中心的科学家。该研究发表在该杂志上eNeuro，与凯瑟琳大萨堡和Svitlana V. Bach，Ph.D.，Uab神经生物学系，作为联合第一作者。

“随着CRISPR技术的发展，我们能够选择性地编辑基因和基因表达水平，”Vanderbilt University Vanderbilt大脑研究所的助理教授，博士·卡佩里说，博士·克里帕里说，他们没有参与其中学习。“这提供了一种强大的新工具，用于将基因表达和基因调节的影响链接到细胞功能和行为;但到目前为止，这些系统主要针对细胞培养的优化。”

卡利帕里说:“虽然这听起来微不足道，但将基因工具从培养到体内使用是极其困难的。这项技术将彻底改变这些系统在体内的使用，以便将特定脑区特定基因的转录调节因子的变化与神经活动和行为联系起来。此外，这些工具将允许在清醒和行为的动物中，对个体基因或基因组进行特定区域的操纵，这将给我们一个前所未有的视角来看待基因表达在行为中。“

“了解控制这一过程的基本机制，”她说，“是开发选择性治疗精神疾病的第一步。”

研究细节

CRISPR / CAS9系统被广泛称为分子剪刀，可在基因组中的精确位点切割以除去基因或添加基因。无法切割DNA的无活性形式的CRAP / CAS9可以与转录效应器连接，以在精确的位置激活基因的表达。一天和同事使用这个系统，称为CrisPra。他们把它封装在慢病毒中，以便稳定的Crisprmer机器表达，让研究人员测试其调节神经元基因的能力。该系统包括具有激活剂的CRISPR缺陷-CAS9和一个引导RNA，其将CRISPR-DCAS9引导到基因组上的精确点。

在神经元中使用Crispra的一个限制是通常用于驱动其他类型细胞中的分子机械的启动子在驾驶神经元中的Cr Clup表达时无效。为了规避这一点，UAB研究人员基于人类Synapsin的启动子序列或SYN，基因的启动子序列选择了神经元特异性启动子，以在神经元中表达其Crispra工具。UAB研究人员然后开发了CRISPR单导向RNA，将该系统靶向一系列不同的基因，从小转录因子到大细胞外蛋白。他们表明，该系统显着诱导了对来自皮质，海马和脑纹状体的原代大鼠神经元中的每种基因靶标的表达。

使用多个单个引导RNA，称为多路复用，允许可调谐上调单个基因，或协调多种基因的上调。

UAB团队还在非常复杂的脑基因，脑源性神经营养因子或BDNF上测试了该系统。由于其复杂的转录调节，BDNF非常难以研究，但它在各种过程中的核心作用是重要的，例如神经元分化和生存，树突生长，突触发育，长期增强和记忆形成。BDNF具有九个不同的启动子位置，并且各自导致变体mRNA转录物。

“由于这种复杂性，我们试图描述个体Bdnf mrna在其中的独特功能作用神经元产生了相互矛盾的结果，目前可用的工具要么缺乏选择性上调单一Bdnf转录变体的能力，要么需要繁琐的分子克隆协议来生成基因特异性靶向结构，”Day说。

当天和同事能够在BNDF的两个不同网站上专门使用CRISPR-DCAS9系统来专门针对单一启动子。每次诱导该位点的转录物，而不改变任何其他启动子的表达。然后，它们表征了每个独特的转录物下游诱导的差异表达基因，并测量神经元生理的变化。

最后，研究人员在成人大鼠中验证了它们的基因调控系统，使用立体定向手术，将携带克切者的慢病毒注入前额叶皮质，海马和核心尿道。

“我认为我们刚刚开始划伤基因调节类型的表面，现在可以通过产生这样的效应耦合的DCAS9工具，”普林斯顿神经科学研究所助理教授佩特琳·詹森佩尼亚，博士说，谁没有参与这项研究。“这在神经科学中打开了激动人心的可能性，特别是为了研究脑功能和脑疾病的复杂性。”

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