保持冷静:下一代测序的等温PCR

（欧宝娱乐地址医用Xpress）-IN DNA测序的领域，聚合酶链式反应（PCR）是通过重复加工所谓的一种良好的用于扩增特异性DNA序列的良好工具反应鸡尾酒在不同的温度。尽管如此，还是有其他的DNA序列特异性扩增方法可以做到这一点不需要反应温度变化，因此称为序列特异性等温放大技术。这种方法具有极快而不需要热循环仪的双重优势。最近，遗传系统组的科学家们在Life Technologies Inc.在加州开发了一种划算的原位(字面上，位于原始的、自然的或现有的地方)等温放大法的基础上所谓的模板行走机制-一种创建待扩增基因信息DNA副本的工具——使用一对低熔点(Tm)固体表面均聚物引物和一个低Tm溶液相引物，可在不到30分钟内生成数十亿个单克隆菌种。该方法可以在下一代测序流程芯片的单车道上产生超过10亿个亚微米大小的菌落。研究人员说，他们的方法——旨在下一代测序(NGS)，在这种方法中，高通量技术并行化，从而缩短测序过程——可以简化临床基因组应用，使长期寻求的1000美元基因组成为可能。此外，该团队还展示了另一种选择配对结束使用Interstrand DNA照片交联以共价将原始模板的互补链连接到固体表面的测序方法。

遗传系统首席科学家老开勤讨论了他、马兆春及其同事进行的研究欧宝娱乐地址。“实现成本效益，高效有两种键原位下一代测序的PCR扩增，”Lao说欧宝娱乐地址。“首先;引物的序列需要低复杂性，例如同源聚合物。第二，两个表面引物之间的距离必须在引物的长度内。”在这种情况下，老挝音符，长度为2-4纳米。

使用模板行走机制的困难之一是找到具有强股位移活性，高处理率和60℃的最佳活动的聚合酶。“这熔点温度均聚物的引物要比反应温度大约60？c，“老挝注意”，允许DNA双层两端的有效底漆侵入，而无需完全变性模板。“

通过将片段文库转化为使用含有脱氧嘌呤和反向引物的正向引物将片段文库转化为切屑文库，最小化DNA插入物的引物与DNA插入物的Poly-T或TTG重复区域之间的Mishymisization。“我们的原始方案具有化学或热变性步骤，”老挝解释。“。后，我们意识到CTT三联重复序列是溶液引物可以退火和延伸以产生更短的模板的更复杂基因组中的常见短串联重复之一。为了克服这一点，我们使用了试剂治疗以产生切口覆盖的折痕覆盖在基因组序列保持双链体的同时用表面引物进行素，以防止溶液引物退火。“研究人员绰号了这个策略沃森保护克里克，老挝Quips。

老挝指出，他们还开发了一种替代配对结束测序方法，其不同于BPCR（桥接或跳跃，PCR）使用Interstrand DNA照片交联以共价将原始模板的互补链连接到坚硬的表面。“模板行走有一个固相底漆和一个溶液相底漆，因此当完全只有一端的菌落锚定到固体表面时，”老挝解释。“对于成对读数，另一端需要在反向测序之前连接到固体表面。我们花了很长一段时间在缩写CNVK碱作为快速照相交叉连接试剂之前搜索有效的DNA交联试剂。我们还花了大量时间来找到没有的特定缓冲区组合物;在正向测序期间与CNVK基础反应，同时保护模板免受照片损坏。“

由于单一的洞察力，科学家们解决了这些复杂的挑战 - 即乔治教堂的1999年的玉米纸¹。“这篇论文一直在我的脑海中，”老挝感到抱歉。“挑战是如何固定扩增的模板，同时允许行走股来扩散到附近的菌落形成多克隆菌落。”

科学家们表示，他们的方法可以用于NGS平台，通过注入新鲜的酶混合物，使1000美元的基因组成为可能。“相比之下，”劳指出，“如果我们假设每个循环使用相同数量的酶，bPCR试剂的消耗将是模板行走的17或35倍。此外，bPCR的两个引物都在表面形成两条链，在测序前需要去除其中一条互补链。“相比之下，所有的延伸表面引物都有可测序的模板，因此菌群强度至少是bPCR的两倍，这将允许更长的读取时间，更简单的仪器，更便宜的激光和成像系统。”

“模板行走大大降低了菌落形成试剂的成本超过10-20倍，”老挝持续“是基于BPCR的当前NGS测序试剂总费用的约60％，而测序引物和探针小于40％。从纯粹的技术角度来看，基于货物成本，今天的技术已经实现了1,000美元的基因组测序。“

展望未来，老挝表示，模板行走也可用于替换通用PCR，因此可以在任何模拟或数字PCR平台上实现。“这还将为护理点诊断应用启用电池供电的手持设备。”此外，他补充说，模板行走将使NGS作为定量PCR（QPCR）与没有热循环的集成样本到图书馆到落肠球 - 目前是实验室技术的主要挑战之一。

就可能从他们的研究中受益的其他研究领域而言，老挝得出结论，模板行走的等温放大性质可以使其能够实现在活的有机体内全部或甚至生存，细胞的扩增。

---

---

©2013医学欧宝娱乐地址快讯。保留所有权利。